甲基苯丙胺对瞬时外向钾电流影响

甲基苯丙胺对瞬时外向钾电流影响

摘要:目的观察甲基苯丙胺(Meth)对瞬时外向钾电流的影响及原因。方法将怀孕18dSD大鼠胎鼠海马神经元分为对照组和Meth处理组，利用全细胞膜片钳方法记录外向瞬时钾电流变化;采用原位末端转移酶标记技术(TUNEL)观察Meth引起的细胞损伤作用;利用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法观察瞬时外向电流成分中Kv1．4、4.1、4.2和4.3表达，并通过western-blot方法观察Kv4.2蛋白表达。结果与对照组［(87.4±12.5)pA/pF］比较，Meth能引起瞬时外向钾电流增大［(120.1±19.6)pA/pF］(P＜0.01)，与对照组(1.00±0.18)比较，Meth处理组凋亡率为对照组的(7.11±0.95)倍(P＜0.01)，钾通道抑制剂4-氨基吡啶(4-AP)明显抑制神经元凋亡(P＜0.01);Kv4.2可能是外向电流成分中主要贡献者，Meth能上调Kv4.2通道蛋白表达;与Kv4.2上调密切相关的Kchip2/3、Kchip4、CaMK2蛋白表达增高。结论Meth引起的瞬时钾电流增大可能通过Kv4.2上调来实现，但其机制仍需进一步探讨。

甲基苯丙胺(Meth)俗称冰毒，是目前最为常见的精神兴奋剂之一，全世界约有1500～1600万使用者，仅次于大麻，Meth滥用已经成为国际重大公共卫生问题［1］。Meth滥用可引起一系列负面作用［2］，研究表明，Meth可引起神经退行性改变［3］。尽管目前Meth毒性及其机制已经部分明确，但大多数研究仍集中于对多巴胺能和血清素能神经元探讨。而Meth造成皮层灰质、海马神经元损伤机制仍然不明。研究发现，Meth使用者脑形态发生明显变化，尤其是海马发生明显收缩［4］。而电压依赖性钾通道(Kv)对维持细胞体积，介导细胞凋亡起重要作用［5］，因此，基于Meth可引起海马形态学变化及钾离子在细胞体积维持中作用，本研究采用怀孕18dSD大鼠胎鼠海马神经元，观察甲基苯丙胺(Meth)对瞬时外向钾电流影响及原因，结果报告如下。

1材料与方法

1.1主要试剂与仪器清洁级怀孕18dSD大鼠(南京医科大学实验动物中心)，许可证号:SYXK(苏)2008－0007，以胎鼠海马神经元为研究对象。兔抗微管相关蛋白2(microtubule associated protein-2，MAP-2)(美国Invitrogen公司)，兔抗Kv4.2(美国chemicon公司)，小鼠抗pan-KChIP(美国NeuroMab公司)，兔抗CaMK2抗体(美国abcam公司)，methamphetamine、小鼠抗β-actin(美国Sigma公司)，原位末端转移酶标记(TdT-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL)试剂盒(美国Roche公司)，无血清培养液、B27(美国Gibco公司)。电极制备:记录用的微电极用硼化玻璃毛细管(内径1.6mm，美国WPI公司)经微电极二步拉制仪(美国Sutter公司)两步拉制而成。充灌内液后，电极电阻阻抗为3～6MΩ。

1.2海马神经元分离取出海马组织，剪碎，用0.25%蛋白胰酶，同时加入100μL的DNAse消化，15～20min后，以胎牛血清中和，吹打细胞，离心;加入汉克平衡盐缓冲液(hank sbalanced salt solution，HBSS)，吹打分离，先后经100、40μm网筛过滤。离心，弃上清，加入细胞培养液，吹打使细胞悬浮。计数，以适当密度接种于培养皿中，每3d细胞换液。细胞以抗神经元特异性抗体MAP-2进行鉴定。

1.3全细胞膜片钳记录采用全细胞电压钳记录模式，给予细胞一组从－80mV至+80mV、以20mV递增的去极化刺激方波，持续时间为200ms，引出4－AP敏感型电流。利用AXON1440A数模转换器对信号进行收集，采集和滤波频率分别为5和1kHz，所记录电流经放大器放大后，采集储存于计算机中。系统电阻、漏电流和电容电流由手动补偿，慢电容补偿率75%～80%。所有记录均在室温(21±2)℃下完成。

1.4TUNEL实验检测细胞凋亡实验步骤参照试剂盒说明。凋亡细胞呈现绿染，4'，6-联脒-2-苯基吲哚二盐酸盐(4'-6-diamidino-2-phenglindole，DAPI)染核呈蓝色，荧光显微镜在400倍下，各处理组随机选取10个视野，平行双样，重复3次，计算各处理组凋亡率=绿染细胞数/DAPI蓝染细胞总数×100%，将对照组细胞凋亡率标化为1，进行各组间细胞凋亡比较。

1.5Kv1.4、4.1、4.2、4.3表达采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法，引物序列如下:Kv1.4:上游5'-CCATACCTACCTTCTAAT-3'，下游5'-TCACACATCAGTCTCCAC-3'。Kv4.1:上游5'-TCACAGGGAAGAGATCTTGA-3'，下游5'-ACTAGCGGGTCTTCGGAGGA-3'。Kv4.2:上游5'-CCGAATCCCAAATGCCAATGTG-3'，下游5'-CCTGACGATGTTTCCTCCCGAATA-3'。Kv4.3:上游5'-GCAAGCGCAATGGACTCCTCAA-3'，下游5'-GAAGGGCTTCTGGTGGATGGGTAG-3'。GAPDH:上游5'-TCAAGAAGGTGGTGAAGCAG-3'，下游5'-AGGTGGAAGAATGGGAGTTG-3'。反应程序如下:94℃预变性5min，28个循环，94℃变性30s，60℃退火45s，72℃延伸60s，10min72℃末次延伸。对于Kv1.4，退火温度设为52℃，其余相同。

1.6Western-blot检测Kv4.2表达海马神经元经Meth处理后，提取总蛋白，蛋白上样量为10μg，电泳，转膜，一抗4℃过夜。二抗孵育1h，化学发光液显色，曝光。灰度以ImageJ软件进行分析。

1.7统计分析所有数据以珋x±s表示，由Clamfit10、Origin8和SigmaPlot软件分析处理，应用单因素方差分析或t检验进行统计学分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1Meth对瞬时外向钾电流影响(图1)电生理结果显示，对照组和Meth处理组(图1B)4-氨基吡啶(4-aminopyridine，4-AP)敏感型钾电流分别为(87.4±12.5)PA/PF(n=10)和(120.1±19.6)pA/pF(n=7)，与对照组比较(图1A)，Meth组明显增大(t=－4.901，P＜0.01)。

2.2Meth对海马神经元凋亡作用细胞与1000μmol/LMeth共同孵育48h，然后利用TUNEL的方法观察神经元凋亡。Meth处理组与对照组(1.00±0.18)比较，细胞凋亡率为对照组的(7.11±0.95)倍(P＜0.01)。与Meth处理组比较，钾通道抑制剂4-AP(1mmol/L)干预组(4.96±1.32)细胞凋亡明显降低(F=67.495，P＜0.01)。

2.3瞬时外向钾电流主要成分在海马神经元中表达(图2)结果显示，Kv4.2mRNA表达较其余3种亚型钾通道为高，图2B为内参GAPDH表达条带。

2.4Meth对Kv4.2蛋白表达影响(图3)细胞与100μmol/LMeth分别孵育4、16h后，Kv4.2表达明显增高(图3A)。同时明显上调KchiP家族中KchiP2、KchiP3/4(图3C)以及CaMK2(图3B)表达，而KchiP1条带则没有明显变化。

注:A、B:分别为对照组、Meth处理组瞬时外向钾电流;C:瞬时外向钾电流密度I-V曲线(aP＜0.05，bP＜0.01)。

图1Meth孵育16h对瞬时外向钾电流影响

注:A:Kv1.4、4.1、4.2和4.3mRNA表达条带;B:GAPDH表达条带。

图2海马神经元中主要瞬时外向钾通道表达注:A:Kv4.2蛋白表达;B:CaMK2表达;C:Kchip1、2、3、4蛋白表达;D:β-actin表达。

图3Meth对海马神经元中Kv4.2及KchiPsCaMK2蛋白表达影响

3讨论

外向钾电流主要包含2种电流成分即瞬时外向和延迟整流型成分，前者可被4-AP拮抗，称为4-AP敏感型钾电流，后者可被四乙胺(tetraethylamine，TEA)阻断，称为TEA敏感型钾电流。在外液中加入20mM/LTEA，可对4-AP敏感型电流进行记录。本研究结果显示，Meth明显增大瞬时外向钾电流，抑制剂4-AP则明显抑制由Meth引起的神经元损伤，提示4-AP敏感型钾通道可能是Meth引起海马神经元损伤靶点之一。海马神经元中存在Kv1.4、4.1、4.2、4.3等多种瞬时外向成分。其中Kv4.2在调节神经元兴奋中及可塑性过程中起重要作用［6］。本研究结果亦表明Kv4.2在海马神经元中表达最为丰富，提示Kv4.2可能在Meth引起的细胞损伤中起作用。此外，Meth与细胞作用4、16h后明显上调海马神经元中Kv4.2表达，这一现象与电生理实验中Meth引起瞬时外向电流增大结果一致。最近，有研究指出，在海马神经元中，Kv4.2表达和CaMK2以及KchiP家族蛋白表达相关［7－8］。前者上调可引起Kv4.2表达增高，后者KchiP家族蛋白中，Kchip2、Kchip3/4与Kv4.2共定位于海马神经元中，在Kv4.2由胞浆向胞膜转移过程中起关键作用［8］。本研究结果表明，Meth作用神经元后，CaMK2和Kchip2、Kchip3/4表达均增高，提示Meth可能一方面通过CaMK2促进Kv4.2高表达，另一方面通过上调Kchip2、Kchip3/4促进Kv4.2向胞膜上转移，引起电流增大。